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ARTP誘變選育TreY-TreZ途徑高產海藻糖菌株及酶促反應條件優化

作者:admin 發布時間:2018/03/01 瀏覽量:1898

自然界中的海藻糖多是由兩個葡萄糖殘基經α-11糖苷鍵構成的非還原性二糖,廣泛存在于低等植物、藻類、細菌、真菌、昆蟲等生物體內。海藻糖不但能夠作為一些生物體的能源物質,它還是一種重要的應激代謝產物。研究表明海藻糖無論在生物體內還是體外均可以保護生物細胞及活性大分子,使其免受高溫、干旱、冷凍、高滲等環境下的破壞。因此,海藻糖在分子生物學、醫藥、食品、化妝品等領域有著廣泛的應用前景。


 現已研究發現,海藻糖在生物體內有多種合成途徑,其中麥芽寡糖基海藻糖途徑(TreY-TreZ途徑)以廉價的淀粉為原料,利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyl trehalose synthaseMTSaseTreY基因編碼)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose  hydrolaseMTHaseTreZ基因編碼)的協同作用,將一定鏈長的直鏈淀粉轉化為海藻糖。該途徑具有特異性較高,快速溫和等優點,是工業化生產海藻糖的重要方法之一。目前國內酶法生產海藻糖的轉化率較低,成本較高,限制了海藻糖的廣泛應用,因此獲得高MTSaseMTHase酶活力的菌株是酶法生產海藻糖的關鍵。ARTP誘變是近幾年發展起來的新型誘變技術,它具有對操作者安全、環境友好、操作簡便、突變快速、突變率高、獲得的突變體性狀穩定等特點,目前已經應用到各類微生物育種過程中。


 本研究以實驗室保藏的節桿菌屬菌株Arthrobacter sp. SH為出發菌株,經常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasmaARTP)誘變選育后,篩選到一株以淀粉為原料TreY-TreZ 途徑生產海藻糖的高產突變菌株 Arthrobacter sp. SH-52。該突變菌株酶催化能力達到 129.6U/m L,比出發菌株提高了46.1%。對菌株Arthrobacter sp. SH-52的酶促反應條件進行優化,結果表明,酶促反應最適溫度45℃,最適反應時間30h,最適初始pH6.5,最適底物為濃度20%的淀粉液化液(DE值為11.9)。經酶促反應優化后,采用未經純化的粗酶液進行催化,轉化率達到37.6%


  實驗結果表明 ARTP 誘變是選育高酶活海藻糖生產菌的有效方法,研究結果對工業化生產海藻糖具有一定的借鑒價值。


1.誘變菌株篩選:

1 菌株的誘變篩選

Table1 The screening result of Arthrobacter sp. SH 


2.誘變菌株 SH-52 粗酶液酶法制備海藻糖的工藝優化

2 海藻糖合成途徑的初步驗證

Table 2 Preliminary validation of trehalose synthesispathway


2 反應溫度對轉化率的影響

Fig.2 Effect of reaction temperature on conversionrate


3 反應初始 p H 對轉化率的影響

         Fig.3 Effect of initial p H on conversion rate

4 DE值對粗酶液催化反應的影響

        Fig.4 Effect of DE value on conversion rate

5 反應時間與底物濃度對轉化率的影響

Fig.5 Effect of reaction time and substrateconcentration on conversion rate

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